Alicyclobacillus ...

[ Pobierz całość w formacie PDF ]
LABORATORIUM 5/2009
|
LABORATORIUM
PRZEMYSŁOWE
Alicyclobacillus
acidoterrestris
– przetrwalnikująca bakteria skażająca soki
STRESZCZENIE
Alicyclobacillus
acidoterrestris jest Gram-dodatnią bakterią
przetrwalnikującą będącą termoacydofi lem,
powodującą zepsucia płaskokwaśne
soków i konserw owocowych. Artykuł
poświęcony jest ogólnej charakterystyce
bakterii z rodzaju Alicyclobacillus,
a także metodom izolacji, detekcji
i identyfi kacji tego mikroorganizmu
w żywności. Omówione zostały również
wady, głównie soków owocowych,
powodowane przez te drobnoustroje,
a związane z powstawaniem związków
o nieprzyjemnym zapachu.
SŁOWA KLUCZOWE
Alicyclobacillus,
zepsucia soków owocowych, gwajakol
rie przetrwalnikujące w żywno-
ści o niskim pH wykrywane były
bardzo rzadko. Powszechnie uważano,
że mikroorganizmy te nie mogą rozwijać
się w środowisku o wartości pH niższej
od 4,5. Dlatego też pierwsze raporty
pojawiające się w latach 90. dotyczące
zakażenia soków owocowych o niskim
pH przez przetrwalnikujące bakterie
Gram-dodatnie przyjmowane były z du-
żym sceptycyzmem. Coraz liczniejsze
przypadki zepsuć, głównie soków owo-
cowych, a także intensywne badania
bakterii je wywołujących, doprowadziły
do izolacji i identyfikacji nieznanych
wcześniej szczepów termotolerancyj-
nych i termofilnych organizmów, które
przeżywają pasteryzację i inne zabiegi
termiczne, a także są acydofilami. Mi-
kroorganizmy te, blisko spokrewnione
z przetrwalnikującymi bakteriami z ro-
dzaju
Bacillus
, na podstawie badań filo-
genetycznych, a także cech wspólnych
(m.in. obecności

-alicyklicznych kwasów
tłuszczowych w błonach komórkowych)
zostały zaklasyfikowane do jednego ro-
dzaju –
Alicyclobacillus
.
specyficznych związków odpowiada
za wyjątkową odporność bakterii
Ali-
cyclobacillus
na niskie pH i wysoką tem-
peraturę. Podczas gdy cecha ta ogólnie
uważana jest za odróżniającą bakterie
Alicyclobacillus
od innych mikroorgani-
zmów, należy zaznaczyć, że wszystkie
gatunki
Sulfobacillus
, jak również
Cur-
tobacterium pusillum
i
Propionibacterium
cyclohexanicum,
także zawierają znaczące
ilości tych kwasów tłuszczowych w bło-
nach. Ponadto ostatnio sklasyfikowany
gatunek –
A. pomorum
– nie zawiera zna-
czących ilości

-alicyklicznych kwasów
tłuszczowych. Przetrwalniki bakterii
Alicyclobacillus
są tworzone terminalnie
lub subterminalnie i mogą powodować
odkształcanie sporangium. Powstawa-
nie łańcuszków jest rzadkie, a ruchli-
wość słaba. Młode komórki barwią się
Gram-dodatnio i stają się Gram-ujemne
lub Gram-zmienne w miarę starzenia
się hodowli. Wielkość kolonii zależy
od medium hodowlanego, sięgając
2-5 mm (czasami większe) na stałym
podłożu YSG w optymalnej temperatu-
rze wzrostu. Morfologia kolonii może
się nieznacznie różnić w zależności
od szczepu, ale najczęściej tworzone
są kolonie kuliste. Niektóre starsze kul-
tury mogą wydawać się zakażone z po-
wodu heterogennej morfologii. Kolonie
przyjmują barwę od białej do beżowej,
ciemniejąc z wiekiem. Ich połysk nie
jest całkowity. Wzrost pod powierzch-
nią podłoża jest ograniczony z powodu
mniejszej dostępności tlenu. Bakterie
Alicyclobacillus
mogą rosnąć w tempe-
raturze od 20°C do 70°C, z optimum
pomiędzy 40°C a 60°C, i w zakresie
pH od 2,0 do 6,0, z optimum pomiędzy
3,5 i 4,5. Ograniczony wzrost obserwo-
wany jest przy wartościach temperatury
i pH wykraczających poza zakres opti-
mum. Pomimo że bakterie te są ścisłymi
tlenowcami, mogą krótko rozwijać się
SUMMARY
Alicyclobacillus
acidoterrestris is a Gram-positive spore-
forming thermophilic acidophilic bacilli
that spoil fruit juices and preserves.
The article includes the general
characteristics of the Alicyclobacillus
genus, as well as methods of isolation,
detection and identification of these
microorganisms in food. The type of
spoilage associated with A. acidoterrestris
and attributed to the formation of the
offensive-smelling compounds have
also been discussed in the review.
KEY WORDS
Alicyclobacillus,
fruit juices contamination, guajacol
OGÓLNA
CHARAKTERYSTYKA
RODZAJU
ALICYCLOBACILLUS
Bakterie
Alicyclobacillus
są Gram-do-
datnimi pałeczkami, termoacydofi-
lami, wytwarzającymi przetrwalniki,
a także fakultatywnymi tlenowcami.
Wyróżniają się zdolnością do wzro-
stu w szerokich granicach pH (głów-
nie od 2,0 do 6,0) i obecnością

-alicyklicznych kwasów tłuszczowych
(np.

-cykloheptanu,

-cykloheksanu
lub

-cykloheksylowych kwasów tłusz-
czowych) (rys. 1 – str. 22) jako głów-
nych składników błon. Niektórzy ba-
dacze przypuszczają, że obecność tych
dr inż. Paweł Satora
KATEDRA TECHNOLOGII FERMENTACJI I MIKROBIOLOGII TECHNICZNEJ
UNIWERSYTET ROLNICZY W KRAKOWIE
20
D
o lat 80. ubiegłego wieku bakte-
 LABORATORIUM
PRZEMYSŁOWE
|
LABORATORIUM 5/2009
w warunkach mikroaerobowych (wzrost
jest hamowany brakiem tlenu). Meta-
bolizują one bardzo większość cukrów,
produkując kwasy, czemu nie towarzy-
szy powstawanie gazu. W zależności
od stanu odżywienia komórek, obec-
ność soli, kwasów organicznych, poli-
fenoli i alkoholi ponad pewne granicz-
ne stężenie może zahamować wzrost,
jednakże niektóre szczepy są odporne
na te czynniki. Diagnostyka rodzaju
obejmuje obecność

-alicyklicznych
kwasów tłuszczowych w błonach ko-
mórkowych oraz wzrost i produkcję
endospor w warunkach tlenowych
w temperaturze 45°C i pH 3,0. Do od-
różnienia od bakterii
Sulfobacillus
wy-
korzystuje się zdolność do asymilacji
siarczku żelaza lub siarki jako źródła
energii. Acydofilna i termofilna natura
rodzaju jest ogólnie dobrze scharaktery-
zowana, jednakże specyficzne warunki
wzrostu zależą od gatunku i szczepu
mikroorganizmu. Rodzaj
Alicyclobacillus
obecnie obejmuje 11 gatunków, z któ-
rych
A. acidoterrestris
,
A. acidocaldarius
i
A. pomorum
izolowane były z zepsu-
tych soków owocowych i są obecnie
jedynymi gatunkami z rodzaju odpo-
wiedzialnymi za zakażenia soków.
się w zakładach produkujących soki
lub napoje, zwłaszcza podczas cie-
płych miesięcy letnich. Niektóre zakła-
dy produkujące skoncentrowane soki
owocowe regenerują wodę powstającą
z soku podczas koncentracji i używają
jej do czyszczenia linii i pomieszczeń.
Regenerowana woda jest ciepła lub go-
rąca i lekko kwaśna, stanowi więc odpo-
wiednie środowisko dla rozwoju bakterii
Alicyclobacillus
. Wisse i Parish wskazują
na obecność znaczących ilości bakterii
Alicyclobacillus
w kondensacie pozyski-
wanym podczas zagęszczania soków
cytrusowych. Woda ta używana bywa
zarówno do mycia urządzeń i owoców,
jak i w niektórych przypadkach do eks-
trahowania z pulpy owocowej cukrów
resztkowych. Dostarczana do wyparki
i mieszana z sokiem, tuż przed proce-
sem zatężania może powodować stałe
zakażenie koncentratu produkowanego
w zakładzie bakteriami
Alicyclobacillus
.
Aby zapobiec powyższemu zjawisku, nie-
zwykle istotne jest zwracanie szczególnej
uwagi na czystość wody regenerowanej,
a także oczyszczanie całej wody wyko-
rzystywanej w zakładzie.
ŹRÓDŁA ZAKAŻENIA
BAKTERIAMI
ALICYCLOBACILLUS
Przedstawiciele rodzaju
Alicyclobacillus
zostali po raz pierwszy wyizolowani
z próbek gleby pochodzących z gorących
źródeł w prowincji Tokohu w Japonii.
Gatunki
Alicyclobacillus
były wykrywane
również w innych środowiskach i sub-
stratach, takich jak: obszary geotermalne,
osady wód termalnych, małe rzeki i poto-
ki oraz podwodne gorące źródła. Obec-
ność
Alicyclobacillus
w tych środowiskach
wskazuje na ich duże rozpowszechnienie.
Gleba wydaje się głównym rezerwuarem
przetrwalników
A. acidoterrestris
i uważa
się, że owoce ulegają zakażeniu poprzez
kontakt z glebą w trakcie zbioru. Soki
owocowe zakażane są w wyniku prze-
twarzania niemytych lub słabo umytych
owoców, a także używania zakażonej
sporami wody. Jako termoacydofile,
bakterie
Alicyclobacillus
mogą namnażać
się w ciepłych warunkach, w kwaśnym
środowisku. Warunki te mogą pojawić
reklama
ALCHEM GRUPA Sp. z o.o.
87-100 Toruń, ul. Polna 21
tel. 056 655 05 49, fax 056 623 41 04
e-mail:
alchem@alchem.com.pl
OGÓLNOPOLSKA SIEĆ ZAOPATRZENIA LABORATORIÓW
ŁĄCZY NAS CHEMIA...
SKC – ŚWIATOWY LIDER WŚRÓD ASPIRATORÓW
Chcesz prowadzić badania środowiska w zakresie zanieczyszczeń
powietrza? – Wybierz SKC
Jako bezpośredni przedstawiciel firmy SKC Ltd. w swojej ofercie posiadamy bogatą gamę aspiratorów i akcesoria do poboru prób powietrza
(zanieczyszczeń chemicznych i pyłów). Oferujemy indywidualne rozwiązania dopasowane do potrzeb klienta. W ofercie SKC Ltd. znajdziecie
Państwo ponad 150 różnych rodzajów rurek z takimi sorbentami, jak: Silica Gel, Anasorb 727, Anasorb 747, Anasorb CMS, Anasorb CSC,
Anasorb GCB1, Anasorb GCB2, Anasorb PC, JXB Charcoal Xad-2, Xad-7, Tenar TA, Tenar GR. Przy tak szerokim spektrum sorbentów
jesteście Państwo w stanie pobierać próby powietrza, gazów na zawartość ok. 500 związków organicznych i nie tylko. Alternatywnym
rozwiązaniem poboru prób są worki TEDLAR, które dostępne są u nas z trzema rodzajami zaworów (PP, PTFE, stal nierdzewna).
Oferujemy:
– Aspiratory indywidualne (pompki)
– Akcesoria do poboru prób
zanieczyszczeń powietrza
– Akcesoria od poboru prób
zanieczyszczeń biologicznych powietrza
– Kompletne zestawy
do poboru prób środowiskowych
– Kalibratory
– Rurki sorbentowe
– Rurki wskaźnikowe
– Worki Tedlar
Stargard
Szczeciński
091 573 50 06
Zapraszamy na www
.skcltd.
com
Zaprojektujemy i wyposażymy TWOJE laboratorium
i będziemy przy TOBIE w codziennej pracy laboratoryjnej
ISO 9001:2008
Zarządzanie Jakością
www.alchem.com.pl
21
 LABORATORIUM 5/2009
|
LABORATORIUM
PRZEMYSŁOWE

-cykloheksylowy kwas tłuszczowy

-cykloheptylowy kwas tłuszczowy
Rys. 1.

-alicykliczne kwasy tłuszczowe
Gwajakol
2,6-dibromofenol
2,6-dichlorofenol
Rys. 2. Struktura związków odpowiedzialnych za wady powodowane przez bakterie
Alicyclobacillus
WADY SOKÓW
POWODOWANE
PRZEZ BAKTERIE
ALICYCLOBACILLUS
W ostatniej dekadzie
A. acidoterrestris
stał
się główną przyczyną psucia się pasteryzo-
wanych soków owocowych. Początkowo
takie przypadki uważane były za spora-
dyczne, jednakże badania sondażowe
prowadzone od 1998 roku dowiodły,
że ponad połowa badanych producen-
tów soków spotykała się z przypadkami
zakażeń wywoływanych przez bakterie
termoacydofilne. Zakażenia zwykle wy-
stępowały w okresie o podwyższonej
temperaturze, a najczęściej ulegały nim
soki jabłkowe. pH psujących się soków
wynosiło zwykle od 3,2 do 4,1, a zakaże-
nie wykrywano głównie dzięki pojawieniu
się charakterystycznego zapachu, ze zmęt-
nieniem lub bez niego. Tego rodzaju
zepsucia notowano w różnych sokach
owocowych, w tym w jabłkowym, grusz-
kowym, pomarańczowym, brzoskwinio-
wym, mango i z białych winogron, jak
również w mieszankach soków, napojach
zawierających soki owocowe oraz pro-
duktach z pomidorów, tj. soku pomido-
rowym i pomidorach konserwowanych.
Dotychczas nie zaobserwowano jednakże
zakażeń soków z czerwonych winogron,
co może być związane z obecnością
w nich pewnych związków fenolowych,
które mogą hamować wzrost bakterii
Alicyclobacillus
. Poziom alkoholu wyższy
niż 6% ma inhibujący wpływ na wzrost
A. acidoterrestris
, dlatego rozwój tych bak-
terii inhibowany jest w winach białych,
natomiast cydry mogą być narażone
na zepsucie.
Alicyclobacillus acidoterrestris
powoduje płaskokwaśny typ zepsucia,
głównie związany z tworzeniem gwajakolu
(rys. 2) – związku o odrażającym zapachu.
Innymi związkami chemicznymi o de-
zynfekcyjnym zapachu produkowanymi
przez bakterie z rodzaju
Alicyclobacillus
są halofenole, takie jak 2,6-dichlorofenol
(2,6-DCP) i 2,6-dibromofenol (2,6-DBP)
(rys. 2). Gwajakol (2-metoksyfenol) jest
często używanym dodatkiem do żywno-
ści, nadającym jej słodki i palący smak.
Jego zapach opisywany jest jako aromat
wędzonego bekonu. W produktach pra-
żonych tworzony jest w wyniku termicz-
nego rozkładu prekursorów fenolowych
i odpowiedzialny jest m.in. za aromat
kawy Arabiki i słodu jęczmiennego.
Próg wyczuwalności gwajakolu w sokach
owocowych wynosi około 2 ppb, a jego
zawartość jest w nich dużo mniejsza niż
w winach białych – 0,02 mg/l. Gwajakol
jest obecny w większych stężeniach w so-
kach owocowych i jest bardziej lotny niż
halofile, dlatego uważany jest za główny
związek pojawiający się w wyniku zakaże-
nia
A. acidoterrestris
. Jest on produkowa-
ny przez
Alicyclobacillus
z waniliny. Kwas
wanilinowy, który powstaje w wyniku
oksydacji waniliny i jest następnie dekar-
boksylowany do gwajakolu, może natu-
ralnie pochodzić z lignin lub być obecny
jako wynik zakażenia soków owocowych.
Kwas ferulowy, główny komponent lignin,
jest początkowo przekształcany do wa-
niliny lub 4-winylogwajakolu w wyniku
dekarboksylacji. 4-winylogwajakol jest
utleniany do waniliny, następnie kwa-
su wanilinowego, a po dekarboksylacji
powstaje gwajakol. Prekursorem gwaja-
kolu może być również aminokwas ty-
rozyna. Naturalny sok jabłkowy zawiera
do 4,1 μl tyrozyny na 1 ml, podczas gdy
jego wyższe stężenia – do 13,5 μl/ml –
znajdują się w soku pomarańczowym.
Do czynników wpływających na pro-
dukcję gwajakolu przez
Alicyclobacillus
należą: obecność mikroorganizmu, tem-
peratura przechowywania i zastosowany
szok cieplny. Gwajakol wykrywany był
zarówno w soku jabłkowym, jak i po-
marańczowym, kiedy
A. acidoterrestris
występował w stężeniu 10
5
jtk/ml przez
4 dni. Uważa się również, że produkcja
gwajakolu zwiększa się wraz ze wzrostem
temperatury inkubacji. Za produkcję
gwajakolu odpowiedzialne są aktywne
komórki wegetatywne, dlatego szok ter-
miczny prowadzi do aktywacji wzrostu
spor. Przyspieszenie tworzenia gwajakolu
może być wskaźnikiem obecności
A. aci-
doterrestris
w produktach żywnościowych.
Halofenole 2,6-DCP i 2,6-DBP również
22
 LABORATORIUM
PRZEMYSŁOWE
|
LABORATORIUM 5/2009
PRODUKT
PODŁOŻE HODOWLANE
pH
WARUNKI HODOWLI
TEMPERATURA
°C
CZAS
DNI
Sok jabłkowy
K agar
Orange serum agar (OSA)
Orange serum agar (OSA)
B. acidocaldarius
medium (BAM)
3,7
ns
3,7
4,0
44
44
43
46
2
2
2
3
Soki jabłkowy i winogronowy
Agar ziemniaczano-glukozowy (PDA)
5,6
43
5
Drinki jabłkowe i pomarańczowe
Zmodyfikowany agar YPG
4,0
40 lub 45
3
Soki jabłkowy i pomarańczowy, mieszanka soków
owocowych
K agar
3,7
43
3
Soki jabłkowy, pomarańczowy, winogronowy,
grejpfrutowy, limonkowy, mango, papaja,
brzoskwiniowy, ananasowy i pomidorowy
BAM
4,0
50
2
Sok pomarańczowy
PDA
BAM
ns
4,0
55
44 ± 1
2
6
Koncentrat z pomarańczy, czarnej porzeczki
Zmodyfikowany BAM
4,0
45
3
Soki pomarańczowy i gruszkowy, nektar
pomarańczowy
ALI agar
3,5
45
1-2
Jabłka
K agar
3,7
42
7
Jabłka
K agar
3,7
44
2
Suszony kwiat hibiskusa (do herbaty)
YSG agar
3,7
50
5
Tabela 1. Przykładowe podłoża i warunki inkubacji próbek stosowane podczas izolacji bakterii
Alicyclobacillus
z owoców i produktów owocowych
SKŁADNIK
ALI AGAR
BAT AGAR
K AGAR
YSG AGAR
BAM AGAR
CaCl
2
x 2H
2
O
K
2
HPO
4
MgSO
4
x 7H
2
O
(NH
4
)
2
SO
4
Glukoza
Pepton
Pepton proteozowy
Skrobia rozpuszczalna
Tween 80
Ekstr. drożdżowy
Woda dejonizowana
Pierwiastki śladowe
Agar
0,25 g
3,0 g
0,5 g
0,2 g
1,0 g
–
–
2,0 g
–
2,0 g
1000 ml
–
15-20 g
0,25 g
3,0 g
0,5 g
0,2 g
5,0 g
–
–
–
–
2,0 g
1000 ml
1 ml
a
15-20 g
–
–
–
–
1,0 g
5,0 g
–
–
1,0 g
2,5 g
1000 ml
–
15-20 g
–
–
–
–
1,0 g
–
–
2,0 g
–
2,0 g
1000 ml
–
15-20 g
–
4,0 g
–
–
5,0 g
–
5,0 g
–
–
5,0 g
1000 ml
–
15-20 g
Tabela 2. Skład najczęściej wykorzystywanych podłóż mikrobiologicznych do izolacji bakterii
Alicyclobacillus
a
–
roztwór zawierający 0,66 g/l CaCl
2
·2H
2
O, 0,30 g/l Na
2
MoO
4
·2H
2
O, 0,18 g/l ZnSO
4
·7H
2
O, 0,18 g/l CoCl
2
·6H
2
O, 0,16 g/l CuSO
4
·5H
2
O, 0,15 g/l MnSO
4
·4H
2
O, 0,10 g/l H
3
BO
3
powiązane są z zakażeniami wywoływa-
nymi przez
A. acidoterrestris
. Podobnie jak
w przypadku gwajakolu, związki te od-
powiedzialne są za „medyczne” lub „de-
zynfekcyjne” nuty zapachowe. 2,6-DCP
i 2,6-DBP mogą dostać się do produktów
owocowych dwoma sposobami – poprzez
skażenie chemiczne i/lub syntezę mikro-
biologiczną. Skażenie chemiczne następu-
je wtedy, kiedy sok owocowy ma kontakt
ze słabym roztworem fluorowca, pocho-
dzącego ze środka odkażającego używa-
nego do mycia surowych owoców lub
linii produkcyjnych. Jeżeli nie zostanie
on całkowicie usunięty, mogą powstawać
2,6-DCP i 2,6-DBP. Dodatkowo związki
te mogą być tworzone na drodze syntezy
bakteryjnej. Związki fenolowe, nadtlenek
wodoru i jony halogenkowe odgrywają
znaczącą rolę w tworzeniu halofenoli
i halogenacji. Obecność tych trzech
grup związków w soku owocowym, wraz
z bakteryjnym enzymem haloperoksydazą,
może spowodować powstanie większych
ilości 2,6-DCP i 2,6-DBP. Poziom wyczu-
walności dla 2,6-DBP w wodzie wynosi
0,5 ppt. Mimo że dokładny poziom wy-
czuwalności halofenoli w sokach owoco-
wych nie jest do końca znany, wiadome
wartości szacowane są na 0,5 ppb dla 2,6-
DCP i 30 ppt dla 2,6-DBP. Czynnikiem
wpływającym na produkcję halofenoli
przez
A. acidoterrestris
jest typ podłoża
zawierającego bakterie (zepsucie wykry-
wane było jedynie w soku owocowym,
a nie w zakwaszonej wodzie). Kolejnym
czynnikiem, od którego zależy produk-
cja halofenoli, jest wielkość przestrzeni
nad sokiem w opakowaniu. Im większa,
tym bardziej intensyfikuje się rozwój
A. acidoterrestris
i analogicznie synteza
halofenoli.
IZOLACJA I WYKRYWANIE
BAKTERII Z RODZAJU
ALICYCLOBACILLUS
Obecnie nie istnieją standardowe me-
tody izolacji i identyfikacji bakterii
Alicyclobacillus
w sokach owocowych.
Dwiema głównymi metodami izolacji
są posiew powierzchniowy na płytki
oraz metoda membranowa. Metoda fil-
tracyjna umożliwia analizowanie prób
o dużych objętościach. Jej zaletą jest
również wykrywanie niskiego poziomu
zakażenia, ponieważ technika ta po-
woduje zagęszczenie komórek mikro-
organizmów. Z reguły wykorzystuje się
membrany o średnicy porów 0,45 μm,
wykonując następnie posiew na odpo-
wiednie podłoże hodowlane. Czułość
metody zwiększa przetrzymanie próbki
w temperaturze 80°C przez 10 minut
przed przefiltrowaniem, co eliminuje
23
 LABORATORIUM 5/2009
|
LABORATORIUM
PRZEMYSŁOWE
ulegają zakażeniu
Alicyclobacillus acidoterrestris
poprzez kontakt z glebą
w trakcie zbioru.
mikroflorę kompetencyjną i aktywuje
spory bakteryjne. Filtracja może być
jednak stosowana tylko do roztworów
klarownych, ponieważ większe cząstki
występujące w roztworze mogą powo-
dować zapychanie się filtra. Dla produk-
tów nieklarownych, takich jak mętne
soki, proponuje się oznaczenie najbar-
dziej prawdopodobnej liczby (NPL).
Określenie liczebności techniką NPL
powinno być prowadzone przy użyciu
odpowiedniego podłoża bulionowego,
takiego jak sterylizowany filtracyjnie sok
lub minimalny bulion odżywczy o ni-
skim pH (bulion Ali lub BAT). Wzbo-
gacanie próbek jest niezwykle ważne
w przypadku małego stężenia komórek
Alicyclobacillus
w zatężonych sokach,
purée i nektarach. Tego rodzaju zabieg
zwykle obejmuje inkubację próbki,
rozcieńczonej w minimalnym podłożu
bulionowym, które zawiera substancje
mineralne i składniki pokarmowe lub
samą wodę. Po rozcieńczeniu próbki
są poddawane szokowi termicznemu,
a następnie inkubowane w temperaturze
40-55°C przez 3 do 7 dni. Pod koniec
inkubacji próbki są posiewane na odpo-
wiednią pożywkę, a płytki inkubuje się
w warunkach tlenowych w temperaturze
45-50°C przez kilka dni. Rozwój kolo-
nii sugeruje obecność
Alicyclobacillus
,
jednakże wymagane są dalsze analizy
potwierdzające uzyskane wyniki. Przy
określaniu poziomu zakażenia istotne
są również używane podłoża mikrobio-
logiczne. Do izolacji bakterii
Alicycloba-
cillus
wykorzystuje się głównie podłoża
OSA, PDA, BAM, K agar i agar z eks-
traktem drożdżowym (tab. 2 – str. 23).
Wartość pH podłoża podczas izolacji
ma wpływ na stopień odzysku komórek
Alicyclobacillus
(tab. 1 – str. 23). Dla tego
etapu zalecane jest pH 3,7, a tempera-
tura inkubacji powinna kształtować się
w granicach 30-60°C. Wyższe tempera-
tury, takie jak 40-45°C, promują wzrost
Alicyclobacillus
, a hamują rozwój innych
mikroorganizmów nietermofilnych. In-
kubacja w temperaturze 50-53°C po-
wstrzymuje wzrost ciepłoodpornych
pleśni, takich jak
Byssochalmys
, bez
zmniejszenia wykrywalności
Alicycloba-
cillus
. Kolonie powstałe po wzbogacaniu
lub bezpośrednim posiewie na podłoża
o niskim pH muszą być poddane od-
powiedniej technice analitycznej, aby
potwierdzić ich klasyfikację do rodzaju
Alicyclobacillus
. Wstępnie powinno zostać
przeprowadzone badanie mikroskopo-
we, aby stwierdzić, że izolat nie jest fer-
mentatywnymi drożdżami lub innymi
acydofilnymi organizmami, a jest Gram-
dodatnią bakterią przetrwalnikującą. Ba-
danie potwierdzające obejmuje również
posiew na podłoże o niskim pH i ho-
dowlę w podwyższonej temperaturze
(45-55°C). Jednym z proponowanych
protokołów badania potwierdzającego
jest posiew powierzchniowy podejrza-
nej kolonii na dwie płytki z podłożem
o niskim pH i dwie płytki z obojęt-
nym pH. Jedną płytkę z danym podło-
żem inkubuje się w 45-50°C, a drugą
w 20-25°C przez odpowiedni okres.
Wzrost na podłożu inkubowanym
w 45°C, mały wzrost lub jego brak
w 25°C na agarze o niskim pH oraz
brak wzrostu na pozostałych płytkach
świadczy o obecności
Alicyclobacillus
.
Najpewniejsze wyniki daje jednak analiza
sekwencyjna specyficznego dla gatunku
regionu DNA lub RNA, takiego jak
podjednostka rybosomalna 16S, wraz
z określeniem charakterystyki fenoty-
powej (termoacydofilne, Gram-dodatnie
bakterie przetrwalnikujące).

Piśmiennictwo
1. Duvenage W.: Detection and isolation
of thermophilic acidophilic bacteria from
fruit juices. Master’s Thesis, Stellenbosch
University, 2006.
2. McClure P.J.: Spore-forming bacteria. [W:]
Food Spoilage Microorganisms. Woodband
Publishing Ltd, 2006.
3. Murray M.B., Gurtler J.B., Ryu J.H., Harri-
son M.A., Beuchat L.R.: Evaluation of direct
plating methods to enumerate Alicyclobacil-
lus in beverages. „Int. J. Food Microbiol.”,
2007, 115, 59-69.
4. Parish M.E.: Spoilage of juices and beverages
by Alicyclobacillus spp. [W:] Microbiology
of Fruits and Vegetables. Taylor and Francis
Group, LLC, 2006.
5. Yokota A., Fujii T., Goto K.: Alicyclobacillus
– Thermophilic Acidophilic Bacilli. Springer,
2007.
24
U
waża się, że owoce
[ Pobierz całość w formacie PDF ]